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但等到丰臣秀吉统一了东瀛之后，他从支持者，几乎一夜之间变成了迫害者。
天正14年（1586年/明万历14年）6月19日，秀吉颁《伴天连追放令》，宣布驱逐传教士。但是，他顾忌影响海外贸易，实际上法令并没有彻底落实。
英国学者贝利指出，《令》颁布后，10余名传教士依然滞留长崎并担任葡萄牙商船长崎贸易的向导，130余名耶稣会士仍九州布教，教徒数量仍迅勐增加，而以西班牙方济各修道会为代表的其他势力也开始进入日本。
但是，秀吉的动机，深深的影响了德川家康。德川家康统一日本后，对秀吉宗教和贸易分离的政策，深以为然。
他禁止天主教，为的是防止关西信教诸侯，勾结海外势力作乱，也为了限制他们通过外贸壮大自己的实力。
从这时候开始，幕府对教徒的迫害逐步开始加剧。
庆长2年（1597年/明万历25年），秀吉下令把日本信徒及方济各会修道士总计26人长崎钉死十字架上，次年，丰臣秀吉病死伏见城。
庆长18年，家康已经明令禁止家臣信教的情况下，大名有马晴信的宗教信仰败露，旋即被剥领流放。随即被迫让家臣杀死。
庆长19年1月，退居幕后的德川家康授意二代将军德川秀忠，组织起草了新的《伴天连追放令》，即“庆长禁教令”。
宣布驱逐日本所有传教士，其中包括89名耶稣会士、4名方济各会修道士、2名多明我会修道士、2名奥古斯丁会修道士。
